目的探讨肠道菌群-短链脂肪酸轴在婴幼儿乳糖不耐受（LI）异质性中的作用机制。方法选取2024年6月至2025年4月在徐州医科大学附属医院因腹泻确诊LI的138例患儿为研究对象。根据LI的严重程度分为轻度LI组(n=68)和重度LI组(n=70)，再选取同期50例健康保健儿童作为健康对照组。通过16S rRNA基因测序分析肠道菌群结构，气相色谱-质谱联用（GC-MS）定量粪便短链脂肪酸含量，建立婴儿肠道类器官模型验证关键短链脂肪酸的功能机制。结果与健康对照组比较，轻度LI组、重度LI组Shannon指数、双歧杆菌属丰度、双歧杆菌属与大肠埃希菌属丰度比值（B/E）更低，且重度LI组低于轻度LI组（P<0.05）；与健康对照组比较，轻度LI组、重度LI组大肠埃希菌属/志贺菌属丰度更高，且重度LI组高于轻度LI组（P<0.05）。与健康对照组比较，轻度LI组和重度LI组总短链脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸水平更低，且重度LI组低于轻度LI组（P<0.05）。多元线性回归预测模型为腹泻频率=6.80-0.17×丁酸+0.25×大肠杆菌-0.31×双歧杆菌，该模型预测效能的曲线下面积为0.89（95%CI：0.83~0.94）。与对照肠细胞比较，乳糖处理的肠细胞跨上皮细胞层电阻(TEER)、紧密连接蛋白（Claudin）-3水平更低，IL-8水平更高，而乳糖+丁酸处理的肠细胞TEER、Claudin-3水平较乳糖处理的肠细胞更高，IL-8水平更低（P<0.05）。结论肠道菌群失衡与丁酸缺乏共同导致婴幼儿LI症状差异。